Riassunto
Scopo del lavoro: negli ultimi anni, l’utilizzo del laser a bassa intensità per la rigenerazione di tessuti molli e duri è stato fortemente incrementato. Tuttavia, gli effetti della luce laser applicata a basse dosi direttamente sugli osteoblasti non sono stati ancora del tutto studiati. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare l’effetto dell’irradiazione con un laser a diodi sulla proliferazione di cellule osteoblastiche.
Materiali e metodi: cellule umane di osteosarcoma (U2OS) sono state irradiate con un laser a diodi con lunghezza d’onda continua di 915 nm e a differenti livelli di potenza (0,5 e 5 watt). La proliferazione cellulare è stata valutata dopo 24 e 72 ore sia attraverso l’attività delle deidrogenasi mitocondriali (MTT) che tramite microscopia ottica.
Risultati: l’irradiazione singola o ripetuta per 60 sec a 5 w ha indotto un significativo aumento della proliferazione cellulare dopo 24 ore, mentre la stimolazione ripetuta a 40 e 60 secondi ha indotto un effetto significativo dopo 72 ore. La stimolazione singola a 0.5 w per 60 secondi è stata in grado di determinare un effetto significativo sulla proliferazione cellulare a 24 ore dalla stimolazione.
Conclusioni: i nostri risultati suggeriscono che l’irradiazione laser, sia a 0.5 w che a 5 w, ha un effetto biostimolante sugli osteoblasti in vitro.
Candidato: Carlo Rengo
Relatore: Prof. Sergio Matarasso
Correlatore: Prof. Michele Nicolò
L’Odontoiatria rappresenta una branca medica la cui rapida e continua evoluzione è legata a numerosissimi studi e ricerche che permettono all’odontoiatra moderno di avvalersi di sempre più nuovi strumenti e tecnologie. Questo ha consentito di migliorare notevolmente la compliance del paziente, il quale oggi non si rivolge più al dentista solo per un problema patologico ma, spesso, anche o unicamente per motivi estetici. Il continuo aggiornamento e l’apprendimento di nuove metodiche e operatività, unitamente alla conoscenza delle evidenze scientifiche che ne sono alla base, sono i presupposti fondamentali per consentire all’odontoiatra di ottenere il miglior risultato possibile dal punto di vista funzionale, estetico ed economico. Gli attuali mezzi di comunicazione e i sistemi informativi hanno permesso, inoltre, una larga e rapida diffusione delle conoscenze scientifiche e delle nuove possibilità terapeutiche nel pubblico, imponendo un corretto e continuo aggiornamento da parte degli operatori odontoiatrici. Una delle più recenti tecnologie introdotte sul mercato odontoiatrico è il laser, strumento altamente innovativo per la sostanziale differenza del meccanismo d’azione rispetto alle tecniche tradizionali e per la vastità delle possibili applicazioni terapeutiche. Già utilizzato ampiamente in Medicina, ma anche in altri settori al di fuori di quello medico, il laser in Odontoiatria si propone come tecnica aggiuntiva o anche sostitutiva per il trattamento di problematiche di vario tipo e interesse, dalla Protesi alla Chirurgia, dalla Parodontologia alla Conservativa e all’Endodonzia. La differenza sostanziale tra le tecniche tradizionali e quella laser consiste nella minore invasività di quest’ultima che essendo fondamentalmente una tecnica non a contatto risulta estremamente meno traumatica e quindi più gradita al paziente. Come per tutte le nuove tecnologie anche in campo odontoiatrico la ricerca clinica e di base deve effettuare una valutazione critica di ogni nuovo strumento, mettendo sempre in primo piano le evidenze scientifiche convalidate che lo supportano. Uno dei campi più interessanti e complessi per l’impiego del laser è senz’altro la Parodontologia, branca nella quale il professionista si trova a lavorare su tessuti di vario tipo, sia duri che molli, e dove le tecniche riparative e soprattutto rigenerative hanno un ruolo importantissimo come in nessun altro campo odontoiatrico. L’intento di questo lavoro è valutare la risposta dei tessuti parodontali alla terapia laser che è, ancor oggi, poco conosciuta.
Scopo del lavoro
La terapia laser a bassi livelli energetici (Low Level Laser Therapy, LLLT) è una nuova metodica che si sta affermando in Odontoiatria per il trattamento di alcuni quadri patologici quali gli stati dolorosi, la guarigione delle ferite, la rigenerazione dei nervi e del tessuto osseo. Recenti studi scientifici hanno dimostrato che la LLLT può indurre una migliore guarigione dei tessuti molli, una più rapida rigenerazione delle lesioni nervose e un incremento dell’angiogenesi e della sintesi di collagene attraverso anche il rilascio di fattori di crescita. La stimolazione della sintesi di DNA e RNA e la trasformazione di fibroblasti in mio-fibroblasti sono ugualmente ben documentate scientificamente. In particolare, in campo odontoiatrico la proliferazione degli osteoblasti è di grande interesse clinico per quanto riguarda la rigenerazione dei difetti ossei. Ozawa e collaboratori hanno ottenuto un incremento significativo della formazione di noduli ossei con un laser all’Arseniuro di Gallio e Alluminio in maniera dose-dipendente, dimostrando in vivo che tale incremento è determinato da un aumento dell’attività degli osteoblasti e da una diminuzione del numero degli osteoclasti. Nell’assoluto rispetto del tessuto osseo la LLLT ha dimostrato di essere in grado di modulare anche l’infiammazione. L’esatto meccanismo d’azione che è alla base della biostimolazione cellulare mediante laser è ancora poco chiaro, ma è oggetto di numerosi studi. Per esempio, è stato ipotizzato, come meccanismo biostimolante, l’incremento della sintesi di RNA e la possibile attivazione di componenti della catena respiratoria cellulare o di componenti extracellulari. Un possibile componente extracellulare implicato in tali processi potrebbe essere l’ossigeno generato come radicale libero in seguito all’irradiazione laser. La formazione di adenosina trifosfato (ATP), che è influenzata dall’ossigeno, gioca un ruolo essenziale in questo meccanismo. Un altro possibile meccanismo d’azione potrebbe essere il rilascio di alcuni fattori di crescita come il TGF-ß1 che ha potenti effetti sulla guarigione delle ferite e sulla regolazione dell’apposizione e del riassorbimento osseo. Infatti, il TGF-ß1 stimola la replicazione dei precursori cellulari della linea osteoblastica e ha un effetto stimolante diretto sulla sintesi di osso e collagene. L’esposizione delle cellule al trattamento laser potrebbe influenzare la loro sintesi endogena di TGF-ß1, modulando in tal modo il processo di guarigione e incrementando la qualità di osso neoformato. Pertanto, una terapia laser ottimale potrebbe promuovere la produzione e il rilascio di fattori locali a livelli tali da favorire la formazione ossea. In ogni caso, questo effetto biostimolante è raggiunto solo per un certo range di dosaggi. Infatti, dosaggi troppo bassi non hanno assolutamente alcun effetto e dosaggi troppo alti hanno un effetto ancora minore, mentre un dosaggio ancora più alto può produrre effetti addirittura inibitori. Quindi, l’obiettivo di questo studio sperimentale è quello di valutare in vitro gli effetti dell’irradiazione laser sulla proliferazione cellulare ossea. In particolare, vuole essere chiarita l’efficacia di diversi livelli e tempi di irradiazione apportati tramite un laser a diodi.
Materiali e metodi
Colture cellulari
Come modello di studio in vitro, sono state utilizzate cellule umane di osteosarcoma (U2OS) coltivate in mezzo McCoy’s (Sigma Chemical Co) con aggiunta di 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 100 U/mL di penicillina- streptomicina e 1% L-glutammina e mantenute a 37 °C in ambiente umido al 5% di CO2 (figura 1). Per raccogliere le cellule, le piastre venivano lavate con 2 mL di PBS (Cat. No. P3816, Sigma-Aldrich, Milano, Italia) e trattate con 1 mL di tripsina/EDTA per 5 minuti. La tripsina veniva, poi, inattivata da 4 mL di DMEM e le cellule in sospensione venivano raccolte in tubi da centrifuga da 15 mL (Cat. No.2322-15, Iwaki, Barloworld Scientific, Milano, Italia). Le cellule venivano ciclicamente staccate dal substrato.
Le cellule U2OS erano piastrate in multiwell da 96 pozzetti (Cat. No. 3860-096, Iwaki, Barloworld Scientific) a una concentrazione di 9000 cellule per 200 µL di mezzo di coltura. Dopo 24 ore di incubazione, le differenti linee cellulari venivano irradiate con laser per tempi diversi come descritto in seguito.
Laser e modalità di irradiazione
Per l’irradiazione delle cellule è stato impiegato un laser a diodi (Lasemar 900, DL Medica, Milano, Italia) all’Arseniuro di Gallio (GaAs) con lunghezza d’onda continua di 915 nm e potenza massima di 5 W, collegato a una fibra ottica di diametro pari a 300 nm. La fibra è stata posizionata, tramite un adeguato supporto, sopra le multiwell con il raggio laser perpendicolare rispetto ai pozzetti e a una distanza tale che il diametro dello spot corrispondesse esattamente al diametro di ogni pozzetto (figura 2). Gli esperimenti sono stati condotti in due serie: alta e bassa potenza (5 W e 0,5 W), con massima densità di energia rispettivamente di 246 kJ/cm2 e 37 kJ/cm2. In ogni serie sono stati creati 6 gruppi ognuno costituito da 4 pozzetti di cellule. Il primo gruppo di ogni serie era di controllo, ovvero cellule non irradiate. Nella serie ad alta potenza i restanti 5 gruppi sono stati irradiati rispettivamente per 10, 15, 20, 30 e 40 secondi, mentre nella serie a bassa potenza i tempi sono stati 10, 20, 30, 40 e 60 secondi. Per ogni serie sono state utilizzate 3 piastre multiwell. La prima è stata irradiata solo una volta il primo giorno e controllata dopo 24 ore. Anche la seconda è stata irradiata singolarmente il primo giorno, ma è stata controllata dopo 72 ore. La terza piastra invece è stata irradiata il primo, secondo e terzo giorno e controllata dopo 72 ore.
MTT Test
Gli effetti del laser sulla funzione mitocondriale (respirazione mitocondriale) sono state misurate attraverso il saggio colorimetrico dell’MTT [3 (4,5 dimethylthiazol-2-yl) 2,5 diphenyltetrazolium bromide] che fornisce indirettamente informazioni sulla vitalità della cellula e sulla proliferazione cellulare. La molecola di MTT, dopo l’incubazione con cellule vitali, viene clivata dalle deidrogenasi mitocondriali che convertono il sale tetrazolio MTT idrosolubile di colore giallo in un cristallo formazano insolubile di colore violetto. Dopo l’irradiazione laser le cellule sono state incubate per 24 e 72 ore a 37 °C in atmosfera al 100% di umidità e 5% di CO2. Ciascun esperimento è stato ripetuto almeno 4 volte in quadruplicato. Dopo l’incubazione la multiwell da 96 pozzetti veniva vuotata. Solo le cellule vitali aderenti rimanevano legate al fondo della piastra. In ciascun pozzetto venivano aggiunti 100 µL di MTT (1mg/ml) e la piastra era incubata per 1 ora. Successivamente l’MTT veniva sostituito da 100 µL di DMSO, per consentire la dissoluzione dei cristalli di formazano insolubile formatisi. La piastra è stata agitata delicatamente e incubata per 15 minuti. La densità ottica dei pozzetti della multiwell da 96 è stata letta attraverso l’uso di uno spettrofotometro (Sunrise microplate reader, Tecan Trading, Lausanne, Switzerland) a una lunghezza d’onda di 540 nm e con l’uso del software Magellan 6.2 (Tecan Trading). La media dei valori della densità ottica dell’MTT Test di ogni campione è rappresentativa dell’attività mitocondriale delle cellule dopo l’irradiazione laser. L’attività mitocondriale viene espressa come valore percentuale ed è calcolata nel modo seguente: % Attività mitocondriale = Assorbanza del campione / Assorbanza del controllo x100
L’attività mitocondriale della popolazione controllo viene assunta pari al 100%.
Microscopia ottica
L’analisi della morfologia e della densità cellulare è stata effettuata a 24, 48 e 72 ore, utilizzando un microscopio ottico invertito a luce polarizzata (Motic AE21, Cabrera de Mar, Spain). L’acquisizione delle immagini è stata ottenuta tramite una fotocamera digitale Moticam 2000 (Motic) a ingrandimenti 10x e 100x.
Analisi statistica
La significatività statistica dei risultati è valutata attraverso Analisi della Varianza (ANOVA) seguita dal Tukey-Kramer Test per la comparazione multipla dei trattamenti (p<0.05).
Risultati
La proliferazione e l’attività mitocondriale sono state valutate stimolando le cellule ossee con differenti potenze e tempi di irradiazione. La stimolazione singola con 0.5 W (bassa potenza) per 60 secondi induceva un significativo (p<0.001) incremento della proliferazione dopo 24 ore rispetto alle cellule non trattate, ma anche rispetto alle sollecitazioni fatte per tempi più brevi. Il massimo percentuale raggiunto dall’attività mitocondriale era pari al 117%. Dopo 72 ore dalla stimolazione singola con 0.5 W nessun tempo di sollecitazione aumentava in maniera significativa la proliferazione cellulare, anche se la stimolazione per 60 secondi incrementava leggermente (109%) l’attività mitocondriale. Al contrario stimolazioni ripetute ogni 24 ore per 72 ore non aumentavano la crescita cellulare a nessun tempo di stimolazione (figura 3). Alla stessa maniera la stimolazione a intensità maggiore (alta potenza) con 5W è stata valutata dopo irradiazione per 0-5-10-15-20-40 secondi. Valutando la proliferazione dopo 24 ore dagli stimoli risultava statisticamente significativa (p<0.05) solo la stimolazione singola per 40 secondi; infatti, l’attività mitocondriale aveva un incremento del 25% rispetto al controllo.
Anche dopo 72 ore la proliferazione cellulare risultava notevolmente aumentata (p<0.01) a seguito di una stimolazione singola della durata di 40 secondi. Nessun incremento della proliferazione era evidente a 24 e 72 ore per gli altri tempi di irradiazione studiati. Stimolazioni ripetute ogni 24 ore per 72 ore aumentavano la proliferazione cellulare per tempi di irradiazione di 20 (p<0.05) e 40 secondi (p<0.01). In particolare l’incremento era rispettivamente del 26 e 32% rispetto al controllo (figura 4). Gli effetti dell’irradiazione ad alta potenza erano statisticamente più elevati ed evidenti rispetto a quelli espressi a bassa potenza. In particolare le maggiori differenze erano apprezzabili per stimolazioni di 40 secondi ripetute ogni 24 ore, con una differenza di circa il 30% tra alta e bassa potenza (figura 5). L’analisi microscopica è stata effettuata con due tipi di ingrandimento (10x e 100x) per valutare proliferazione, densità e morfologia cellulare. Le micrografie confermavano i risultati ottenuti tramite MTT Test. Nella stimolazione singola con valutazione degli effetti a 24 e 72 ore era visibile, nelle prove condotte ad alta potenza (5 W), un effetto maggiore dell’irradiazione laser rispetto alle prove a bassa potenza (0,5 W). Allo stesso modo anche dopo stimolazione ripetuta e controllo a 72 ore le micrografie mostravano una maggiore densità cellulare nelle prove condotte ad alta potenza. In tutti i casi il trattamento laser mostrava sempre un incremento di densità cellulare rispetto alle cellule non stimolate.
Discussione
Il laser a diodi è stato recentemente introdotto e proposto in Odontoiatria per svariati utilizzi clinici sia su tessuti molli che duri. Infatti, la sua grande versatilità lo rende adatto per numerosi impieghi: la notevole capacità di taglio insieme all’effetto emostatico permette di eseguire incisioni con ridotto sanguinamento e senza la necessità di effettuare suture, con notevoli vantaggi per la compliance del paziente. Inoltre, può essere impiegato per vaporizzare il tessuto di granulazione nelle tasche parodontali, per interventi di chirurgia parodontale e per la piccola chirurgia orale. Ultimamente è risultato utile anche nel trattamento delle perimplantiti, mentre in Endodonzia è stato suggerito anche per la sterilizzazione di canali infetti. In Conservativa è in grado sia di vaporizzare le carie superficiali che di trattare la sensibilità dentinale. Ulteriori vantaggi sono rappresentati dalla possibilità di eseguire tutti i trattamenti senza anestesia e in assoluto rispetto per i tessuti sani. Oltre a queste applicazioni, recentemente notevole interesse è stato suscitato dall’effetto biostimolante del laser sui tessuti duri e molli. In particolare, numerosi studi hanno concentrato la loro attenzione sui suoi possibili effetti sulla rigenerazione del tessuto osseo. Comunque, nonostante vi siano evidenze scientifiche sull’efficacia della terapia laser nell’incremento della rigenerazione ossea, i meccanismi alla base di tale effetto biostimolante non sono ancora del tutto chiari. Il nostro studio ha valutato in vitro gli effetti dell’irradiazione laser a bassi livelli energetici su cellule osteoblastiche. Lo studio, condotto stimolando le cellule a due differenti livelli di energia e per vari tempi con un laser a diodi, ha dimostrato un effetto biostimolante sulla proliferazione delle cellule ossee. Questo risultato confermava precedenti studi che hanno riportato un aumento della proliferazione ossea in seguito all’irradiazione laser. In particolare, le densità di energia che abbiamo utilizzato sono state variabili e risultavano comprese tra 6 e 37 kJ/cm2 per le cellule irradiate a bassa potenza, e tra 61 e 246 kJ/cm2 per quelle irradiate ad alta potenza.
I maggiori effetti proliferativi erano indotti a tempi e a intensità di stimolazione più elevate. A livelli energetici inferiori non sono stati notati incrementi significativi della proliferazione cellulare, anche se l’attività mitocondriale delle cellule risultava in ogni caso superiore al gruppo di controllo. Questo risultato era in parte in accordo con precedenti studi; infatti Van Breughel et al. hanno dimostrato che dosaggi bassi possono non sortire alcun effetto sulle cellule, mentre al contrario dosaggi troppo alti hanno un effetto addirittura tossico o inibitorio. Questo secondo risultato non è stato riscontrato nel nostro studio in quanto la densità massima di energia che abbiamo somministrato alle cellule era sempre più bassa rispetto ai livelli utilizzati da Van Breughel et al. Una delle possibili cause che potrebbe spiegare l’effetto biostimolante, mostrato nei nostri risultati, potrebbe essere un incremento di temperatura del mezzo determinato dall’irradiazione laser. Infatti, è noto che la temperatura del mezzo può influenzare il comportamento delle cellule e che all’aumento del tempo di irradiazione laser può corrispondere un incremento lineare della temperatura del mezzo stesso. Altro aspetto fondamentale da considerare è la densità cellulare, ovvero il numero di cellule irradiate per cm2. È stato precedentemente osservato che il comportamento delle cellule osteoblastiche in vitro dipende dalla densità cellulare, e che a basse densità predominano fenomeni proliferativi, mentre ad alte densità cellulari predominano eventi differenziativi. In pratica, negli stadi iniziali della guarigione delle lesioni ossee la proliferazione degli osteoblasti predomina precedendo la loro differenziazione. Contrariamente, lo sviluppo della funzione osteoblastica avviene successivamente alla proliferazione cellulare, ovvero nella fase medio-tardiva della guarigione ossea. Nel nostro studio abbiamo utilizzato una densità cellulare pari a 9000 cellule per well che ci ha permesso di valutare un effetto proliferativo fino a un massimo di 72 ore alle potenze più alte. Eventuali effetti sulla proliferazione da noi non riscontrati per livelli di potenza più bassa probabilmente sarebbero stati evidenti per tempi di osservazione e stimolazione maggiori. Ad ogni modo, i nostri risultati confermano che il laser a diodi può avere effetti stimolanti sulla rigenerazione del tessuto osseo e che l’aumento della proliferazione cellulare indotto non è altro che il primo step. Questo nostro risultato confermava quelli ottenuti da Ozawa et al. su cellule ossee di ratto. Ozawa et al. hanno osservato che l’irradiazione laser a bassa energia determinava un incremento significativo nel numero dei noduli ossei in maniera dose-dipendente e contestualmente all’incremento dell’attività della fosfatasi alcalina (ALP). Ciò suggeriva che l’irradiazione laser poteva stimolare sia la proliferazione che la differenziazione degli osteoblasti. Dal momento che gli questi ultimi vengono reclutati come cellule immature progenitrici e si differenziano poi in osteoblasti maturi durante la formazione dell’osso, ci si chiede quali cellule e quale stadio rispondano alla terapia laser.
È stato dimostrato che nelle colture cellulari esposte alla radiazione laser si è ottenuto un incremento significativo dei noduli ossei in particolare tra il giorno 1 e il giorno 12, e che tale incremento è rapidamente scomparso dopo il giorno 13 raggiungendo un plateau. Questo dimostra che l’effetto stimolante del laser avviene durante la fase proliferativa e nello stadio iniziale della differenziazione degli osteoblasti, e non negli stadi tardivi. I noduli ossei, infatti, derivano da osteoblasti precursori immaturi che proliferano e si differenziano in osteoblasti maturi formanti noduli in un periodo di circa tre settimane. Ad ulteriore conferma del fatto che la terapia laser influenza non solo la proliferazione ma anche la differenziazione degli osteoblasti è stata valutata in altri studi la relazione tra l’irradiazione laser e l’attività della fosfatasi alcalina (ALP) e l’espressione dell’osteocalcina, entrambi considerati marker di differenziazione osteoblastica. È stato osservato che le prime cellule progenitrici osteoblastiche non esprimono questi marker, ma vanno incontro a un numero definito di divisioni cellulari prima di differenziarsi in osteoblasti maturi che esprimono tali marker e sono dunque in grado di formare tessuto osseo. Tale differenziazione si verifica in vitro dopo circa 2-3 settimane.
Conclusioni
In conclusione, si evince che sottoponendo cellule osteoblastiche a radiazione laser a bassi livelli energetici si ottiene un iniziale incremento della proliferazione cellulare i cui valori sono massimi intorno alla seconda settimana di stimolazione, dopodiché tale incremento si arresta segnando l’inizio della fase differenziativa, sulla quale il laser ha ancora effetto, determinando una maggiore e più veloce formazione di tessuto osseo calcificato. Quindi, i risultati ottenuti con il nostro studio sono in accordo con le attuali evidenze scientifiche, anche se i dati con potenze energetiche basse non sono risultati del tutto significativi, pur dimostrando una tendenza globale all’incremento dell’attività cellulare. I minori effetti delle basse potenze riportati in questo studio potrebbero essere dovuti a un periodo di valutazione ridotto, e pertanto futuri studi saranno mirati a valutare l’effetto biostimolante sulla proliferazione e differenzazione indotta del laser a diodi per tempi più lunghi rispetto a quelli che sono stati utilizzati nel nostro sistema sperimentale.
Corrispondenza
Carlo Rengo
Dipartimento di Scienze Odontostomatologiche e Maxillo Facciali
Università degli Studi di Napoli “Federico II”, Napoli
Tel/Fax 081.7462080 – carlorengo@alice.it
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